Studije iznova pokazuju da biljke nastale korišćenjem novog genetičkog inženjeringa mogu pokazati višestruke slučajne genetičke promene. Nedavno objavljeni izveštaj Odeljenja za genetički inženjering i životnu sredinu (FGU) objašnjava njihovu relevantnost za procenu rizika.

U mnogim regionima širom sveta se trenutno diskutuje o regulisanju novog genetičkog inženjeringa (NGT) i njegovoj primeni u poljoprivredi – takođe i u Evropi. NGT predstavlja tehnologije poput CRISPR-Cas9 koje na specifičnim mestima u DNK mogu da izmene genom biljaka. One bi trebalo da omoguće precizniju i bržu promenu različitih osobina u odnosu stare genetičke inženjeringe. Komisija Evropske unije je prošle godine predložila uvođenje posebne regulative za NGT-biljke. Argumentom da se genetičke promene kod NGT postupaka ne razlikuju značajno od domaćih metoda uzgajanja, u predlogu zakona nije predviđena procena rizika za prihvatanje određenih NGT-biljaka.

Na osnovu dosadašnjeg zakonodavstva Evropske unije o genetičkom inženjeringu, genetski modifikovani organizni (GMO) koji su nastali iz „rekombinantnih DNK-metoda“, dakle oni koji su nastali iz laboratorije korišćenjem veštačkih procesa proizvodnje, moraju biti regulisani.¹ Godine 2018. Evropski sud pravde je objavio odluku kojom se objašnjava da isti zakon važi i za NGT.² To čini procenu rizika neophodnom „kako bi se identifikovale namerne i nenamerne promene koje mogu proisteći iz genetičkih modifikacija, kao i kako bi se procenio njihov potencijal za štetne uticaje na zdravlje ljudi i životnu sredinu“.

Na osnovu aktuelnih naučnih studija, novi izveštaj FGU³ analizira tehnički status NGT-razvoja. FGU je institucija podržana od strane Federalne agencije za zaštitu prirode (BfN), koja posmatra i procenjuje aktuelne naučne i zakonske razvoje na temu novog genetičkog inženjeringa. Autori opisuju niz slučajnih genetskih promena koje su rezultat NGT-postupaka i koje su relevantne za njihovu procenu rizika. U nastavku smo saželi rezultate do kojih su došli. Radi boljeg pregleda oni su podeljeni u pet kategorija.

ARHIVA PPNS 2021: BIOTEHNOLOGIJA PRUŽA VEĆE PRILIKE I OD POTENCIJALA DIGITALIZACIJE - BRNABIĆ NA KOPAONIK BIZNIS FORUMU


Prvo: Integrisanje preko starog genetičkog inženjeringa

NGT-biljke prolaze kroz proizvodni proces koji se odvija na više nivoa. Za uvođenje genetskih makaza, kao što je CRISPR-Cas9 u ćelije biljaka, koriste se postupci koji su tipični za stari genetički inženjering, kao plazmide koje se sastoje iz stranog DNK. Stoga je rezultat prvog koraka CRISP-Cas9-primene, prema direktivi 2001/18/EG transgena biljka, to jest ona sadrži stranu DNK. Pri tome su nastale nenamerne genetičke modifikacije raznovrsne i razlikuju se od onih koje proizilaze iz konvencionalnog uzgoja. Na primer, promene su otkrivene u epigenetici – dakle u regulatornim elementima gena koji ne utiču na samu DNK-sekvencu, u nizu sekvenci DNK-strukture ili kod funkcionisanja genetskih proizvoda.⁴ Čak i ako se kod biljnih vrsta dobijenih konvencionalnom polnom reprodukcijom uklone strani elementi iz biljnog genoma, nenamerne genetske promene mogu ostati neprimećene u genomu.

Drugo: Slučajno integrisanje transgena

CRISPR-Cas9-primene kao posledice mogu imati nenamerno uvođenje stranih DNK-sekvenci u genom. Ove promene koje mogu biti prisutne kako na ciljanom mestu, tako i na nekom drugom mestu u genomu, prouzrokovane su često integracijom isečaka delova DNK-vektora – „genetskog trajakta“ – kojim se CRISPR-Cas kompleks transportuje u ćeliju. U životinjskim ćelijama je ustanovljeno da nenamerno uvedeni strani DNK fragmenti mogu poteći kako iz vektorske konstrukcije, tako i iz medijuma za rast u laboratoriji.

Treće: Bez integrisanja strane DNK

Takođe i bez integrisanja strane DNK opisane su različite slučajne promene prilikom primene CRISPR-Cas u biljnim ćelijama. Genetske makaze su jedna vrsta nukleaze, odnosno enzima koji su u stanju da gradivne elemente DNK-nukleotide razdvoje jedne od drugih. Poznato je da nukleaze koriste specifične DNK-sekvence određene dužine za povezivanje, nezavisno od pozicije u genomu. Zbog toga nastaje opasnost da će se CRISPR-Cas i druge nukleaze vezati za dodatne takozvane Off-Target-regione koje imaju određenu sličnost sa sekvencama spajanja. Uz to dolaze i takozvani On-Target-efekti, odnosno neželjene promene u ciljnom regionu DNK, kao što su ponavljajuće delecije nukleotida – brisanje gradivnih elemenata DNK, mutacije različitih dužina i veće strukturne modifikacije.

ARHIVA PPNS BRNABIĆ: BIOTEHNOLOGIJA KLJUČNA ZA MEDICINU, POLJOPRIVREDU I PREHRAMBENU INDUSTRIJU - BIĆE MEĐU PRIORITETIMA NOVE VLADE


Četvrto: Efekti sličnih hromotripsi (Chromothripsis-ähnliche Effekte)

Hromotripsis (Chromothripsis) je genetski fenomen kod kojeg može da se pojavi stotinu preuređenih hromozoma u jednom jedinom slučaju. Kod sisara, uključujući i ljude, ovaj fenomen se dovodi u vezu sa rakom i urođenim bolestima. Biotehnološki mutageni, kao na primer nukleaze, koje prouzrokuju dvostruki prekid lanca u DNK (Doppelstrangbruch (DSB), verovatno su uzrok za efekte slične hromotripsi. Ukoliko se dvostruki prekid lanca ne popravi dovoljno brzo, onda može da dođe do odgovarajućeg preuređenja hromozoma. Tek nedavno su i kod biljaka identifikovani efekti sličnih hromotripsi izazvani CRISPR-Cas-om⁵.

Dvostruki prekid lanca se takođe može pojaviti kada su biljne ćelije izložene visokoj dozi zračenja, kao što je to slučaj kod neciljane mutageneze. Razlika kod NGT postupaka jeste to da je primena regionalno specifična i da verovatnoća pojave hromotripsa može da raste obradom određene regije. Primera radi, CRISPR-Cas9 izaziva u biljkama, u kojima postoji puno kopija gena koje treba obraditi, višestruke dvostruke prekide lanca istovremeno. Na sličan način dvostruki prekidi lanca u različitim genima istovremeno mogu da se izazovu takozvanim multipleksiranjem (Multiplexing), odnosno ciljanom modifikacijom više DNK sekvenci.⁶ Iz toga proizilazi da CRISPR-Cas mašinerija može da poremeti mehanizme zadužene za reparaciju u ćelijama i da ih spreči da ponovo proizvode prvobitne, originalne funkcije gena.

Peto: Formiranje novih genetički modifikovanih proizvoda

Primenom CRISPR-Cas-a geni mogu tako da se promene da se ne stvaraju više mRNK – molekuli koji prenose genetske informacije za izgradnju određenog proteina unutar ćelije. Zbog toga se onemogućava nastanak odgovarajućeg proteina. Međutim, mogu i nenamerno da se formiraju i nove mRNK koje mogu da doprinose nastanku novih proteina.

Primera radi, nukleaze mogu dovesti do jednog efekta označenog kao Exon Skipping (preskakanje egzona). Kod ovog procesa mRNK se spajaju drugačije nego što je predviđeno i dovode do nastanka skraćenih mRNK. Proteini koje formiraju biljne ćelije na osnovu informacija u ovim mRNK su isto tako kraći, ali ipak mogu da preuzmu nove, nenamerne funkcije u ćeliji. Osim toga nove mRNK mogu nastati i frejmšift mutacijama (Frameshift-Mutationen). One uzrokuju pomeranje okvira čitanja u DNK sekvenci, što dovodi do pogrešnog ,,prevođenja” DNK informacija.⁷

Preskakanjem egzona (Exon Skipping) i mutacijama pomeranja okvira čitanja (frejmšift mutacijama) nove mRnk i proteini, ili takođe nekodirane RNK mogu da imaju uticaj na regulaciju gena i metabolizam ćelije. Na primer kod pšenice u kojoj je eliminisano 35 kopija gena, razmatrana je frejmšift mutacija kao mogući pokretač za nastanak fragmenata proinflamatornih proteina (entzündungsfördernde Proteinfragmente).⁸

ARHIVA PPNS KORPORATIVNO OZELENJAVANJE


Posledice za sveobuhvatnu procenu rizika

Gore navedena kategorizacija nenamernih genetičkih promena koje nastaju uz pomoć NGT-a pokazuju da je procena rizika neophodna za NGT-biljke. Kao što je pomenuto, ove promene mogu oštetiti velike delove hromozoma i dovesti do nastanka slučajnih genetičkih proizvoda. Iako se neke od ovih genetičkih promena mogu opaziti i u konvencionalnom uzgajanju, one se razlikuju po verovatnoći sa kojom se pojavlju na određenim mestima u genomu. Stoga se ovi efekti ne mogu uopšteno izjednačiti sa onima iz konvencionalnog uzgajanja.

U nekim slučajevima se primenom metode sekvenciranja mogu identifikovati slučajne promene u ćeliji i može se uočiti razlika u odnosu na izvorni genom. U drugim slučajevima, u kojima se promena odvija izvan ciljne regije nukleaze, se teže dokazuju. Pre svega se korišćenjem standardnih PCR testova jedva mogu otkriti velike delecije i hromozomska preuređivanja. Shodno tome važno je kombinovati više pristupa, kako bi se sveobuhvatno procenile slučajne promene u čitavom genomu.

Budući da DNK-sekvenciranje ne može uvek da identifikuje uticaje genetičkih modifikacija potrebno je koristiti dodatne metode za analizu nastalih mRNK i proteina. Tek kada slučajne genetičke promene nisu identifikovane, procena rizika bi trebalo da se fokusira na nenamerne promene. Nakon završetka sveobuhvatne karakterizacije trebalo bi da uslede dalji koraci procene rizika, nešto poput istraživanja funkcionalnosti biljke, njenih fenotipskih obeležja i interakcije sa okolinom.

Ukoliko se previde nenamerne genetičke promene, koje potencijalno imaju štetna dejstva, mogu da ugroze zdravlje, životnu sredinu, a i poljoprivredne proizvode. Zbog toga FGU zaključuje da se promena izazvana korišćenjem novog genetičkog inženjeringa (NGT) mora uključiti u obaveznu procenu rizika, pre nego što se biljke puste u životnu sredinu i stave na tržište.

Reference

1. EU-Parlament und EU-Rat (2001): Directive 2001/18/EC of the European parliament and of the Council of 12 march 2001 on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms and repealing Council directive 90/220/EEC - commission declaration. Online: www.kurzelinks.de/gid268-da.
2. EU-Kommission (2018): Commission Directive (EU) 2018/350 of 8 March 2018 amending Directive 2001/18/EC of the EU Parliament and of the Council as regards the environmental risk assessment of genetically modified organisms. Online: www.kurzelinks.de/gid268-db.
3. Koller, F. / Cieslak, M. (2023): A perspective from the EU: unintended genetic changes in plants caused by NGT – their relevance for a comprehensive molecular characterisation and risk assessment. In: Front. Bioeng. Biotechnol. 11, www.doi.org/10.3389/fbioe.2023.1276226.
4. Koller, F. et al. (2023): The need for assessment of risks arising from interactions between NGT organisms from an EU perspective. In: Environ Sci Eur 35, 27, www.doi.org/10.1186/s12302-023-00734-3.
5. Samach A. et al. (2023): CRISPR/Cas9-induced DNA breaks trigger crossover, chromosomal loss, and chromothripsis-like rearrangements. In: The Plant Cell, Vol. 35, 11, www.doi.org/10.1093/plcell/koad209.
6. Zsögön, A. et al. (2018): De novo domestication of wild tomato using genome editing. In: Nat Biotechnol 36, www.doi.org/10.1038/nbt.4272.
7. Lalonde, S. et al. (2017): Frameshift indels introduced by genome editing can lead to in-frame exon skipping. In: PLoS ONE 12(6), www.doi.org/10.1371/journal.pone.0178700.
8. Sánchez-León, S. et al. (2018): Low-gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9. In: Plant Biotechnol. J. 16, www.doi.org/10.1111/pbi.12837.

Objavljeno u GID-Ausgabe 268, februar 2024.

Pascal Segura Kliesow je molekularni biolog i referent za poljoprivredu i hranu u Gen-etičkoj mreži

Ilustracije: Studyflix; Schrotundkorn
Izvor: Gen-ethisches-netzwerk.de
Prevod: Aleksandra Mijailović i Ana Mijailović, PPNS
Obrada: Prviprvinaskali.com

*Preuzimanje sadržaja je dopušteno, uz navođenje izvora - PRVI PRVI NA SKALI, i postavljanje linka koji vodi do ove stranice

ARHIVA PPNS: PREDAVANJA O GMO

• 2020: prof. dr Tatjana Brankov, prof. dr Miodrag Dimitrijević i prof. dr Miladin M. Ševarlić
• 2021: prof. dr Snežana Oljača, Bogdan Cekić i dr Ivana Radović
• 2022: prof. dr Jelena Bošković i dr Vladan Ugrenović
• 2023: doc. dr Duško Brković i Tina Janjatović 

IZ ARHIVE PPNS INOVACIJE U PREHRAMBENOM SISTEMU: POLJOPRIVREDA KAO SEKTOR GLOBALNE INDUSTRIJSKE EKONOMIJE; GMO; ORGANSKA PROIZVODNJA - PROF. DR TATJANA BRANKOV

PREPORUKA PPNS